化妆品眼刺激性检测：STE体外兔角膜上皮细胞试验全解析

替代动物实验，5分钟出结果！

你知道吗？自从欧盟化妆品法规(EC)No 1223/2009）颁布后，2013年起，欧盟全面禁止化妆品动物测试。中国《化妆品安全技术规范》也早已给出“无动物”检测方案。今天，带你一文读懂官方指定方法——体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验（STE，Short Time Exposure）！

中文：化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验

关键词：5分钟暴露、细胞存活率、无动物、眼刺激性预测

法规依据：《化妆品安全技术规范》2015版第六章毒理学试验方法21（对应 OECD TG 491（2015 发布，2023 更新））

试验目的
用体外培养的兔角膜上皮细胞（SIRC 株）在 5 min 短时暴露后测定细胞存活率，预测化妆品原料的眼刺激性/腐蚀性，替代传统兔眼 Draize 试验

“细胞死了=角膜伤了”

• 采用兔角膜上皮细胞（SIRC细胞）

• 暴露于5%和0.05%浓度的受试物5分钟

• 通过MTT/CCK-8检测细胞存活率，直接对应刺激等级

判定标准

5%浓度存活率	0.05%浓度存活率	结论
> 70%	> 70%	无刺激性或微刺激性
≤70%	> 70%	结果无法判定
≤70%	≤70%	腐蚀性(不可逆眼损伤)

注意：细胞存活率70%是“红线”！高挥发性/固体非表面活性剂需额外验证。

细胞株：SIRC兔角膜上皮细胞（<25代）

培养基：MEM+10%胎牛血清+抗生素

接种密度：96孔板，6000细胞/孔（4天融合80%）

2.受试物处理

浓度：5%和0.05%（10倍稀释）

溶剂优先级：生理盐水→5%DMSO→矿物油（不溶者不适用于本实验）

3.染毒与显色

暴露时间：5分钟

检测法：

-MTT法（经典）：570nm测甲瓒结晶

-CCK-8法（快速）：450nm测甲瓒结晶

4.系统验证（必须全部满足！）

-空白对照OD差值≥0.3

-溶剂对照存活率≥80%

-阳性对照（0.01%SLS）在历史均值±2SD内（默认21.1%-62.3%）

-三次重复标准差<15%

Q：为什么选5%和0.05%？

A：覆盖从极低到极高浓度的刺激阈值，避免漏检。

Q：DMSO会干扰结果吗？

A：溶剂对照必须≥80%存活率，DMSO不得超过5%。

• 替代动物：单只兔眼实验需3只兔子，STE仅需要免眼角膜上皮细胞

• 降低成本：实验周期从2周缩短至3天

• 国际互认：OECD TG491同款方法，出口欧盟必备

• 普通化妆品备案原料眼刺激性筛查

• 原料开发早期的高通量筛选

• 细胞代数：超过25代直接换株！

• 受试物溶解：水溶性优先，沉淀=无效数据

• 边缘效应：96孔板外围加PBS防蒸发

• 结果争议：70%临界值建议重复3次+体外重建人角膜模型验证